Aoasm.ru

Медицинский портал
0 просмотров
Рейтинг статьи
1 звезда2 звезды3 звезды4 звезды5 звезд
Загрузка...

Разработка панели контрольных образцов ДНК вирусов папилломы человека, ее валидация и тестирование в ВПЧ-тестах «Амплисенс»

Разработка панели контрольных образцов ДНК вирусов папилломы человека, ее валидация и тестирование в ВПЧ-тестах «Амплисенс»

В течение последнего десятилетия наблюдается широкое внедрение в российскую лабораторную практику методик и коммерческих тест-систем для выявления и генотипирования ДНК вирусов папилломы человека (ВПЧ). Все эти методики и тесты предназначаются для решения самых разных клинических и эпидемиологических задач и реализуются на основе самых разных технологий. Это приводит к тому, что тесты для выявления ДНК ВПЧ значительно отличаются друг от друга по чувствительности и спектру выявляемых генотипов, что неизбежно увеличивает количество несовпадающих результатов между лабораториями, использующими разные тесты. И, в конечном итоге, создает путаницу в представлениях врачей и пациентов.

Наиболее важная проблема, для разрешения которой необходимо и оправдано использование ВПЧ-тестов – скрининг предраковых заболеваний шейки матки. Наиболее часто используемые для этой цели технологии – гибридизация и полимеразная цепная реакция (ПЦР), обладают разной аналитической чувствительностью и специфичностью. Спектр выявляемых типов ВПЧ варьирует от двух (16 и 18) до всех типов аногенитальной группы α, включающей как типы высокого канцерогенного риска, так и типы низкого и невыясненного канцерогенного риска. Причем, многие из тест-систем российского производства уже получили регистрационные удостоверения, разрешающие их применение в медицинской практике на территории РФ.

Сложившаяся ситуация вызывает необходимость в создании панелей контрольных образцов ДНК ВПЧ для контроля качества производимых реагентов и тест-систем, а также их внедрения в службу внешнего контроля качества выполнения исследований на наличие ДНК ВПЧ. Следует заметить, что проблема отсутствия стандартизованных контрольных образцов ДНК ВПЧ касается не только российской лабораторной службы. В наиболее известных международных системах контроля качества (VQC, QCMD), имеющих контрольные панели для выявления самых разных вирусов, отсутствуют панели, содержащие ДНК ВПЧ.

Цель настоящей работы – разработка панели контрольных образцов, содержащих полные геномы ДНК ВПЧ различных генотипов в разных концентрациях для оценки аналитической чувствительности и специфичности ВПЧ-тестов, предназначенных для скрининга.

Материалы и методы

Получение рекомбинантных плазмид, содержащих полные геномы ВПЧ.

Предварительный анализ литературы показал, что наиболее часто используемые в качестве мишеней участки генома ВПЧ – гены E6, E7, E1, E2, L1 – которые составляют наибольшую часть генома вируса. Поэтому мы решили клонировать максимально протяженные участки генома ВПЧ, содержащие последовательности всех этих генов. Мишень для клонирования получали с помощью ПЦР с использованием специфических праймеров для каждого типа ВПЧ. В качестве матрицы использовали ДНК экстрагированные и очищенные из клинических образцов, содержащих ДНК ВПЧ искомого типа в высокой концентрации. Таким образом, нами были клонированы ДНК ВПЧ 16, 18, 31, 33, 39, 45, 51, 52, 56, 58 и 59 типов высокого канцерогенного риска и ДНК ВПЧ типов низкого (6, 11) и невыясненного (53, 66, 73) канцерогенного риска.

Приготовление растворов контрольных ДНК ВПЧ

Очищенные из клеток E.coli плазмидные ДНК рестрицировали и разводили в ДНК-буфере (ТЕ-буфер, содержащий очищенную ДНК плаценты человека в качестве балласта). Затем измеряли концентрацию разведенных ДНК и готовили разведения с заданной концентрацией. Для разведения использовали отрицательный контроль (NC) из тест-системы «Digene», который представляет собой транспортную среду с добавлением балластной ДНК, имитирующей ДНК клеток человека, необходимой для адекватного проведения теста на основе гибридизации.

ДНК, содержащие геномы ВПЧ типов высокого канцерогенного риска (16, 18, 31, 33, 39, 45, 51, 52, 56 и 58 типов) разводили до концентраций 10 3 , 10 4 ,10 5 и10 6 копий/мл и использовали для оценки чувствительности тест-систем, а ДНК, содержащие ВПЧ типов низкого канцерогенно риска (6, 11, 53, 66, 73) разводили до концентрации 10 7 копий/мл и использовали для оценки специфичности тест-систем.

Кроме растворов перечисленных рекомбинантных плазмид нами использовались также контрольные образцы из тест-системы «Hybrid Capture 2 High Risk HPV DNA Test» фирмы «Digene» (США) и образцы из тренировочной панели «HC2 Training Panel» («Digene», США) содержащие клонированные в плазмиде фрагменты генов E6E7L1 ДНК ВПЧ 16 типа в различных концентрациях. В тест-системе используются два положительных контроля. Первый, калибровочный, HRC (содержит ДНК ВПЧ 16 типа в концентрации 1 pg/ml), используется для нормализации сигнала в образцах. Второй, Quality Control HR (содержит ДНК ВПЧ 16 типа в концентрации 5 pg/ml), используется для контроля качества выполнения теста. Образец А из тренировочной панели (содержит ДНК ВПЧ 16 типа в концентрации 10 pg/ml). Концентрацию ДНК ВПЧ в этих образцах мы также измерили методом лимитирующих разведений.

Читать еще:  Могла ли я забеременеть

Измерение концентрации ДНК ВПЧ в образцах.

Концентрацию рекомбинантных ДНК измеряли методом лимитирующих разведений, используя в качестве мишени ген β-лактамазы, который содержит плазмидный вектор, используемый для клонирования генома ВПЧ. Каждый образец измеряли не менее трех раз и рассчитывали среднее значение по трем измерениям.

Тестирование полученных контрольных образцов в различных ВПЧ-тестах.

Для тестирования контрольных образцов, содержащих ДНК ВПЧ различных генотипов использовали следующие тест-системы:

«Hybrid Capture 2 High Risk HPV DNA Test» (HC2) фирмы «Digene» (США), которая позволяет выявлять ДНК ВПЧ 13-ти типов высокого канцерогенного риска (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 и 68) в концентрации не менее 10 5 копий/мл,

«АмплиСенс ВПЧ-скрин EP» (AC-EP), которая позволяет выявлять ДНК ВПЧ 14-ти типов (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 70) в концентрации не менее 5*10 3 копий/мл,

«АмплиСенс ВПЧ-скрин FEP» (AC-FEP), которая позволяет выявлять ДНК ВПЧ 11-ти типов (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 52, 58, 59, 67) в концентрации не менее 5*10 3 копий/мл,

«АмплиСенс ВПЧ-скрин-титр FRT» (AC-FRT), которая позволяет выявлять и определять концентрацию ДНК ВПЧ 12-ти типов (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59) в концентрации не менее 5*10 3 копий/мл,

При измерении концентрации ДНК в контрольных образцах тест-системы и тренировочной панели «Digene» нами были получены результаты, представленные в таблице 1. При измерении концентрации ДНК в образцах панели контрольных образцов «АмплиСенс» нами были получены результаты, представленные в таблице 2. Результаты тестирования контрольных образцов, содержащих ДНК ВПЧ 16, 1, 52, 18, 39, 45 типов и их разведений представлены в таблице 3. Результаты тестирования контрольных образцов, содержащих ДНК ВПЧ 6, 11, 53, 66 и 73 типов представлены в таблице 4.

Таблица 1. Результаты измерений концентрации ДНК в контрольных образцах «Digene».

Вирус папилломы человека

Вирус папилломы человека (ВПЧ) относится к вирусам подгруппы А семейства Papoviridae, поражающим человека, крупный рогатый скот и птиц. ВПЧ строго эпителиотропен, поражает кожу, слизистые оболочки гениталий и других органов (гортань, бронхи, ротовая полость, глаза). В настоящее время известно более 120 типов ВПЧ. В зависимости от степени онкогенного риска ВПЧ делятся на три группы:

— ВПЧ низкого онкогенного риска (6, 11, 42, 43, 44 типа);

— ВПЧ среднего онкогенного риска (31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 58, 59,68);

— ВПЧ высокого онкогенного риска (16, 18, 48, 56).

Источником возбудителя инфекции является больной человек или носитель.

Пути передачи и инфицирования ВПЧ:

половой путь передачи: инфицирование ВПЧ происходит при генитально-генитальном половом акте, мануально-генитальном и орально-генитальном половых контактах.

— вертикальный путь передачи: доказана повышенная чувствительность эпителия шейки матки к вирусу папилломы человека в период беременности. Известно, что эстрогены и прогестерон увеличивают экспрессию вируса папилломы человека типа 16 в цервикальном эпителии и способствуют клеточной пролиферации и канцерогенезу. Изменение иммунитета при беременности, направленное на сохранение беременности, также способствуют возможности развития ПВИ.

— бытовой путь передачи: допустима, но не подтверждена передача ВПЧ через нижнее белье, хирургические перчатки, инструменты для биопсии и другие предметы, обсемененные ВПЧ.

Факторы риска инфицирования ВПЧ:

— раннее начало половой жизни;

— наличие большого числа и частая смена половых партнеров;

— высокая распространенность инфекций, передаваемых половым путем;

— эндогенные факторы (авитаминоз, изменение иммунного статуса).

Классификация ВПЧ-ассоциированных поражений нижнего отдела гениталий:

  1. Клинические формы (видимые невооруженным глазом):

— экзофитные кондиломы (типичные остроконечные, папиллярные, папуловидные и др.);

— симптоматические CIN (цервикальная интраэпителиальная неоплазия, дисплазия шейки матки).

  1. Субклинические формы (невидимые невооруженным глазом, бессимптомные, выявляемые только при кольпоскопии и/или цитологическом или гистологическом исследовании):

— плоские кондиломы (типичная структура с множеством койлоцитов);

— малые формы (различные изменения многослойного плоского и метапластического эпителия с единичными койлоцитами);

— инвертированные кондиломы с локализацией в криптах;

— кондиломатозный цервицит и вагинит.

  1. Латентные формы (отсутствие клинических, морфологических и гистологических изменений при обнаружении ДНК ВПЧ).
  2. Цервикальная интраэпителиальная неоплазия (CIN) – плоскоклеточные интраэпителиальные поражения (CIN) и рак шейки матки:

— CIN I — слабая дисплазия с койлоцитозом, дискератозом или без них;

Читать еще:  Частые воспаления во влагалище

— CIN II – умеренная дисплазия с койлоцитозом, дискератозом или без них;

— CIN III – тяжелая дисплазия или карцинома in situ с койлоцитозом, дискератозом или без них;

— микроинвазивная плоскоклеточная и железистая карцинома.

В КВД 11 проводится диагностика и лечение ВПЧ:

— Обследование на 14 типов ВПЧ (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68) методом ПЦР реального времени: выявление возбудителя ВПЧ, в ходе которого с помощью метода полимеразной цепной реакции в реальном времени исследуется ДНК вирусов в образце биоматериала. При этом определяется наличие высоко- и среднеканцерогенных типов вируса, производится их типирование.

— Комплексное обследование урогенитального тракта женщин (Фемофлор-cкрин + ВПЧ 14 типов (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68) методом ПЦР в реальном времени + цитологическое исследование материала шейки матки методом жидкостной цитологии.

ВПЧ 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 с определением типа, колич.

ВПЧ 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 с определением типа — количественный анализ, позволяющий выявить вирус папилломы человека высокого онкогенного риска в образце пробы, определить тип и рассчитать количество.

Метод ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени, позволяет определить количество ДНК клинически значимых типов ВПЧ в образце.

Вирус папилломы человека (ВПЧ) — широко распространённое инфекционное заболевание мочеполовых органов, которое может стать причиной возникновения рака шейки матки у женщин и плоскоклеточного рака у мужчин.

  • цервикальной, вульвальной, влагалищной дисплазии шейки матки;
  • преинвазивного и инвазивного рака шейки матки, рака влагалища и перианальной области;
  • остроконечных кондилом половых органов, мочевых путей;
  • генитальных кондилом.

По данным некоторых исследователей, частота инфицирования вирусом прямо пропорциональна числу половых партнёров: при наличии одного партнера, ВПЧ выявляется у 17–20% женщин, при наличии 5 и более партнёров — у 70–80%.

Инкубационный период
Длительность инкубационного периода может длиться от 2 месяцев до 2–10 лет. Для ВПЧ характерно скрытое течение заболевания, при котором отсутствуют клинические проявления и при кольпоскопическом, цитологическом и гистологическом обследовании изменения не выявляются. В 30% случаев в течение 6–12 месяцев может произойти избавление от вируса. Диагностика скрытой ВПЧ-инфекции осуществляется только методом ПЦР.

Клинические проявления
ВПЧ может по-разному воздействовать на эпителий: способствовать возникновению доброкачественных образований (папиллом, кондилом) или объединению ДНК папиллома-вируса с геном клетки, что приводит к дисплазии и неоплазии, в дальнейшем — к раку. Наиболее частая область локализации рака — переходная зоне шейки матки в цервикальный канал.

Клинические формы папилломавирусной инфекции обнаруживают у 40–60% мужчин, являющихся половыми партнёрами инфицированных женщин. Поражения у них вызываются теми же типами ВПЧ, что и у женщин. В 2/3 случаев возникают характерные высыпания на коже и слизистых оболочках половых органов.

  • наличие любых изменений на шейке матки;
  • оценка эффективности вакцинации;
  • контроль проводимой терапии;
  • скрининговое обследование специальных групп женщин.

Женщины
Сдача соскоба не допускается в дни менструации. За две недели исключить приём антибиотиков, за трое суток до взятия — вагинальные свечи, тампоны, спермициды. За сутки до взятия необходимо исключить половые контакты. Нельзя спринцеваться накануне проведения обследования. После УЗИ-исследования должно пройти не менее 48 часов.

Интерпретация результатов
Формат выдачи результата включает отдельный ответ по всем указанным типам ВПЧ. В случае если вирус обнаружен, указывается вирусная нагрузка, которая выражается в Lg ВПЧ/10 5 эпит. клеток. Положительный результат говорит о наличии в образце специфических участков ДНК одного или нескольких типов ВПЧ, с указанием конкретного типа и количества.

Результат «не обнаружено» следует интерпретировать как отсутствие в образце специфических участков ДНК ВПЧ всех указанных типов.

Определение ДНК вируса папилломы человека 16,18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59

Синонимы: ДНК ВПЧ ВКР (высокого канцерогенного риска).

Связанные тесты: клинико-визуальный осмотр, кольпоскопия, гистология, цитологическое исследование мазков (мазки по Папаниколау, ПАП-тест)/жидкостная цитология.

Исследование по определению ДНК ВПЧ ВКР является основным методом диагностики по выявлению вируса папилломы человека в соскобе эпителиальных клеток урогенитального тракта. Молекулярно – биологические методы (ПЦР) позволяют идентифицировать определенные типы ВПЧ и имеют высокую прогностическую значимость, особенно, если на фоне ВПЧ-инфекции уже имеется картина дисплазии эпителия шейки матки, что позволяет говорить о степени риска развития рака.

ВПЧ – инфекция наиболее часто встречающееся заболевание, передающееся половым путем.

Читать еще:  Многоводие в 34 недели

Вирус поражает клетки эпителия кожи и слизистых оболочек. Основным путем заражения ВПЧ является половой путь передачи инфекции (с учетом анального секса и орально-генитальных контактов). Следует отметить, что у 70 % молодых людей в возрасте от 15 до 25 лет ВПЧ элиминируется в течение 18-24 месяцев, после 35 лет ВПЧ сохраняется более продолжительное время. Скорость исчезновения ВПЧ зависит от иммунореактивности клеток организма человека и значительно снижается при инфицировании несколькими типами ВПЧ. Среди лиц, живущих активной половой жизнью, особенно в возрасте до 30 лет, ВПЧ-инфекция с одинаковой частотой поражает и мужчин и женщин. В то же время наиболее серьезные поражения она вызывает у женщин. ВПЧ считается инициирующим фактором в развитии рака шейки матки и рассматривается в качестве причины дистрофических и злокачественных заболеваний вульвы и влагалища.

Выявление и определение типа ВПЧ дает возможность оценивать риск развития неоплазии и дифференцировать персистенцию вируса от случая нового заражения. Риск развития опухолевого процесса в большой степени связан с типом ВПЧ; выявление ДНК ВПЧ высокого онкогенного риска — 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56 и 58 дают основание предполагать, что клетки эпителия могут подвергнуться злокачественному перерождению. Рак шейки матки (РШМ) имеет длительный период развития. Своевременная диагностика предраковых состояний шейки матки имеет важное значение в предотвращении злокачественных новообразований.

В каких случаях рекомендуется проводить исследование?

  • наличие субъективных и/или объективных симптомов заболевания;
  • скрининговые исследования на ИППП;
  • беременность;
  • скрининговое обследование в комплексе с цитологическим исследованием;
  • неопределенные и сомнительные результаты цитологических исследований;
  • дифференциальная диагностика с заболеваниями непапилломавирусной этиологии.

Используемый метод исследования

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) в режиме реального времени.

Материал для исследования

Соскоб эпителиальных клеток из цервикального канала, влагалища, уретры.

Подготовка к исследованию

В предполагаемый день обследования проводиться туалет половых органов без применения моющих, дезинфицирующих средств, антибактериального мыла; исключается спринцевание влагалища у женщин; от последнего мочеиспускания до взятия материала должно пройти не менее 2 часов.

Просим обратить Ваше внимание!

Исследование проводится не ранее, чем:

  • через 2 дня после УЗИ-исследования с помощью влагалищного датчика, гинекологического осмотра;
  • через 5 дней после кольпоскопии и биопсии/жидкостной цитологии;
  • через 2 недели после применения всех видов местных лекарственных форм (свечи, мази и т.п.), антисептических средств и лекарственных препаратов (пробиотики, эубиотики), содержащих микроорганизмы;
  • через 3 недели после незащищенного полового контакта с партнером, в котором Вы не уверенны;
  • через 4 недели после применения системных антибактериальных препаратов и для контроля терапии.

В течение 2 – 3 дней до исследования необходимо воздержаться от незащищенных половых контактов.

За дополнительной информацией о возможности проведения исследования в конкретном случае рекомендуется обратиться по телефонам нашего центра.

Взятие клинического материала у беременных женщин проводится только врачом; необходимо предварительно записаться на прием.

Формат выдачи результата:

Обнаружено / не обнаружено, тип ВПЧ.

Определение ДНК ВПЧ ВКР может говорить о высоком уровне онкогенного риска и необходимости наблюдения в лечебно-профилактических учреждениях.

Цены на исследования Папилломавирусной инфекции

ИсследованияСтоимость, руб.Срок выполнения
ДНК вируса папилломы человека 16 тип91-3 дня
ДНК вируса папилломы человека 18 тип91-3 дня
ДНК вируса папилломы человека 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 типы21,211-3 дня
ДНК вируса папилломы человека КВАНТ- 4 (6, 11, 16, 18 типы), количественное определение25,013-5 дней
ДНК вируса папилломы человека КВАНТ- 15 (6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68 типы), количественное определение33,533-5 дней
ДНК вируса папилломы человека КВАНТ- 21 (6, 11,16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 44, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 73, 82 типы), количественное определение60,413-5 дней

ООО «Биомедика Плюс»

220068, Республика Беларусь,
г. Минск, ул. Червякова 64
E-mail: mail@biomedica.by

Лицензия №02040/6344 от 26 марта 2010г

© 1999-2021
Все права защищены

Время работы центра:

Понедельник — пятница:
08:00 — 20:00
Суббота: 08:00 — 16:00
Воскресенье: выходной

голоса
Рейтинг статьи
Ссылка на основную публикацию
ВсеИнструменты
Adblock
detector